献给初学：常用的细胞凋亡检测方法

在试验中的经常需侦测巨噬细胞的巨噬细胞分裂情况下，这里阐释了几种常见的巨噬细胞分裂侦测步骤，希望都能帮到你。

一巨噬细胞巨噬细胞分裂的基本上学侦测

愈演愈烈巨噬细胞分裂的巨噬细胞在基本上上有一定的特征。

光学精密全像和反转全像

未能切片巨噬细胞：巨噬细胞分裂巨噬细胞的躯积变小、变形，线粒体完整但显现发泡出因，巨噬细胞巨噬细胞分裂早期可见巨噬细胞分裂小躯。贴壁巨噬细胞显现皱缩、变圆、脱落。

切片巨噬细胞：类似于姬姆萨切片、瑞氏切片等。巨噬细胞分裂巨噬细胞的巨噬细胞器油脂、忽视，反应器上皮细胞甘油、巨噬细胞器分割出块状和巨噬细胞分裂小躯等类似的巨噬细胞分裂基本上。

紫外线全像和共计侧重激光扫描全像

一般以巨噬细胞质巨噬细胞器的基本上学变动为指由此可知来入围者巨噬细胞巨噬细胞分裂的进展情况下。

类似于的 DNA 依赖性衍生物有：HO 33342（Hoechst 33342），HO 33258（Hoechst 33258），DAPI。三种衍生物与 DNA 的转化都是非嵌入式的，主要转化在 DNA 的 A-T 碱基区外。紫外线诱导时点火蓝白色的蓝色紫外线。

Hoechst 是与 DNA 特异转化的活性衍生物，储存盐酸用热水配出 1 mg/ml 的沸点，类似于时用 PBS 混合物，未能成沸点为 10 μg/ml。

DAPI 为半通透性，用于正因如此固定巨噬细胞的切片。储存盐酸用热水配出 1 mg/ml 的沸点，类似于未能成沸点一般为 10 μg/ml。

结果入围者

巨噬细胞巨噬细胞分裂流程中的巨噬细胞质巨噬细胞器的基本上学变动划分三期：Ⅰ 期的巨噬细胞质呈色块状（rippled）或呈折缝样（creased），均巨噬细胞器显现油脂静止状态；Ⅱa 期巨噬细胞质的巨噬细胞器较高度汇聚、忽视；Ⅱb 期的巨噬细胞质甘油为碎块，诱导巨噬细胞分裂小躯（布 1）。

透射电子全像观察

结果入围者

巨噬细胞分裂巨噬细胞躯积变小，巨噬细胞质油脂。巨噬细胞分裂Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的巨噬细胞质内巨噬细胞器较高度盘绕，显现许多被称作气穴出因（citations）的空泡在结构上；Ⅱa 期巨噬细胞质的巨噬细胞器较高度汇聚、忽视；巨噬细胞巨噬细胞分裂的早期，巨噬细胞质甘油为碎块，诱导巨噬细胞分裂小躯（布 2）。

二Annexin V 法

胶体酰糖类（Phosphatidylserine, PS）正常人位于线粒体的内侧，但在巨噬细胞巨噬细胞分裂的以前，PS 可从线粒体的内侧翻转到线粒体的颗粒，暴露在巨噬细胞外环境中的（布 3）。Annexin-V 是一种小反应性为 35～36 KD 的 Ca2+ 选择性胶体转化受体，能与 PS 较高亲和力依赖性转化。将 Annexin-V 开展紫外线素（FITC、PE）或 biotin 由此可知识，以由此可知识了的 Annexin-V 作为紫外线电极，透过流式巨噬细胞祯或紫外线全像可侦测巨噬细胞巨噬细胞分裂的愈演愈烈。

碘化丙啶（propidine iodide, PI）是一种反应器酸衍生物，它不用借助完整的线粒体，但在巨噬细胞分裂中的早期的巨噬细胞和死巨噬细胞，PI 都能借助线粒体而使巨噬细胞质红染。因此将 Annexin-V 与 PI 匹配类似于，就可以将巨噬细胞分裂早早期的巨噬细胞以及死巨噬细胞区外拆成来。

步骤

碎屑巨噬细胞的切片：将正常人培育和可借巨噬细胞分裂的碎屑巨噬细胞（0.5～1×106）用 PBS 彩衣 2 次，投身 100 μl Binding Buffer 和 FITC 由此可知识的 Annexin-V（20 μg/ml）10 μl，固体避光 30 min，再投身 PI（50 μg/ml）5 μl，避光羧酸 5 min 后，投身 400 μl Binding Buffer，立即用 FACScan 开展流式巨噬细胞拳法表征侦测（一般不超过 1 h）， 同时以不加有 AnnexinV-FITC 及 PI 的一管作为阴性相异。

贴壁培育的巨噬细胞切片：先用 0.25% 的胰酶消化，彩衣涤、切片和归纳同碎屑巨噬细胞。

爬片巨噬细胞切片：同上，最后用紫外线全像和共计侧重激光扫描全像开展观察。

结果

留意事项

1. 整个操纵动作要尽可能轻柔，切勿用力吹打巨噬细胞。

2. 操纵时留意避光，羧酸完毕后尽速在一小时内侦测。

三反应器糖躯上皮细胞势能的侦测

反应器糖躯在巨噬细胞巨噬细胞分裂的流程中的起着枢纽最重要作用，多种巨噬细胞巨噬细胞分裂刺激因子均可可借不同的巨噬细胞愈演愈烈巨噬细胞分裂，而反应器糖躯横跨电位（Δψm）的下降，被认为是巨噬细胞巨噬细胞分裂并行羧酸流程中的最早愈演愈烈的事件，它愈演愈烈在巨噬细胞质巨噬细胞分裂特征（巨噬细胞器油脂、DNA 断裂）显现之前，一旦反应器糖躯横跨电位崩溃，则巨噬细胞巨噬细胞分裂不可逆转。

反应器糖躯横跨电位的假定，使一些水溶性阳离子紫外线衍生物如 Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide（DiOC6）、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide（JC-1）、Tetramethyl rhodamine methyl ester（TMRM）等可转化到反应器糖躯细胞质，其紫外线的弱化或减弱说明反应器糖躯内上皮细胞电负性的抬较高或提较高。

步骤

将正常人培育的巨噬细胞和可借巨噬细胞分裂的巨噬细胞投身类似于未能成沸点为 Rhodamine 123（1 mM）或未能成沸点为 DiOC6（25 nM），JC-1（1 mM），TMRM（100 nM），37 °C 平衡点 30 min，流式巨噬细胞而所侦测巨噬细胞的紫外线风力。

留意事项

1. 始未能成保持平衡点染盐酸中的 pH 值的一致性，因为 pH 值的变化将影响电位。

2. 与衍生物达到平衡点的巨噬细胞悬盐酸中的如果另有有受体，他们将与均衍生物转化，提较高衍生物的沸点，引致假动作电位。

四DNA 录像化侦测

巨噬细胞巨噬细胞分裂时主要的再生特征是其巨噬细胞器愈演愈烈油脂，巨噬细胞器 DNA 在反应器小躯单位之间的连接处断裂，形出 50～300 kbp 总长的 DNA 大录像，或 180～200 bp 整数倍的寡碱基录像，在发泡液相上表现为四边形液相布谱（DNA ladder）。

巨噬细胞经管控后，改用正因如此步骤分离提纯 DNA，开展琼脂糖发泡液相和溴化乙啶切片，在巨噬细胞分裂巨噬细胞群中的可观察到类似的 DNA ladder。如果巨噬细胞量相当多，还可在分离提纯 DNA 后，用 32P-ATP 和丝氨酸碱基顶端转移酶（TdT）由此可知识 DNA，然后开展液相和不点状自冲印，观察巨噬细胞分裂巨噬细胞中的 DNA ladder 的形出。

大小分子切片躯 DNA 录像的测定

巨噬细胞巨噬细胞分裂的以前，切片躯断裂出为 50～300 kbp 总长的 DNA 大录像。所有超过一定小反应性大小的支链 DNA 小分子在琼脂糖发泡中的的迁往速度相近。频域 DNA 的双螺旋圆周超过发泡圆周时，即达到分辨力的也就是说。此时发泡早已按小反应性的大小来筛分 DNA，DNA 像通过弯管一样，以其一端指向电势一极而通过发泡，这种迁往模式称之为「爬行」。因此，巨噬细胞巨噬细胞分裂以前诱导的 50～300 kbp 总长的 DNA 大录像不用用普通的琼脂糖发泡液相来分离。

通常改用振幅液相新技拳法可圆满地解决这一问题。这个步骤是在发泡上外加有正交的交变振幅电势。每当电势方向变动后，大的 DNA 小分子便驻留在爬行将水的，此后新的的电势轴向再一的定向后，才能继续向前快速移动。DNA 小反应性越大，这种重排所需的整整就越总长。当 DNA 小分子离散方向的整整小于电振幅周期时，DNA 就可以按其小反应性大小拆成。

DNA Ladder 测定

步骤

赚得巨噬细胞（1×107）硫酸→巨噬细胞甘油盐酸→13 000 rpm ×5 min→收集上清，加有 1% SDS 和 RnaseA（5 mg/ml）56 °C，圈养 2 h→受体酶 K（2.5 mg/ml）37 °C，2 h→1/10 躯积 3 mol/l 醋酸钠和 2.5 倍躯积的的水无水乙醇硫酸 DNA，4 °C 驱车→14 000 rpm×15 min→最后将硫酸溶解在 TE buffer 中的，加有 DNA Loading Buffer→1.2% 琼脂糖发泡液相，EB 切片并照相。

结果

巨噬细胞分裂巨噬细胞 DNA 另有量的流式巨噬细胞而所归纳

步骤

收集巨噬细胞→70% 的水乙醇（PBS 混合物）4 °C 固定驱车→PBS 彩衣涤，1 000 rpm × 10 min→RNase A（0.5 mg/ml）37 °C 消化 30 min→PI（50 mg/ml）切片，固体避光 15 min→FACScan 归纳 DNA 亚二倍躯的形出及巨噬有丝分裂的变化。

结果

ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay

低成本：阈值较高，适合于侦测少量样本，小均巨噬细胞分裂巨噬细胞。如临床活该组织侦测。

五TUNEL 法

巨噬细胞巨噬细胞分裂中的，切片躯 DNA 支链断裂或单链断裂而诱导大量的粘性 3'-OH 顶端，可在丝氨酸碱基顶端转移酶（TdT）的最重要作用下，将丝氨酸碱基和紫外线素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形出的衍生物由此可知识到 DNA 的 3'-顶端，从而可开展巨噬细胞分裂巨噬细胞的侦测，这类步骤被称作丝氨酸碱基顶端转移酶巨噬细胞内的缺口顶端由此可知识法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。

由于正常人的或正在增殖的巨噬细胞几乎没有人 DNA 的断裂，因而没有人 3'-OH 形出，相当多都能被切片。TUNEL 基本上是小分子生物学与基本上学相转化的学拳法研究步骤，对完整的单个巨噬细胞分裂巨噬细胞质或巨噬细胞分裂小躯开展原位切片，能准确地羧酸巨噬细胞巨噬细胞分裂类似的生物化学和基本上特征，可用于石蜡包埋该组织切片、冰冻该组织切片、培育的巨噬细胞和从该组织中的分离的巨噬细胞的巨噬细胞基本上测定，并可侦测出极少量的巨噬细胞分裂巨噬细胞，因而在巨噬细胞巨噬细胞分裂的学拳法研究中的被广泛改用。

六Caspase-3 活性的侦测

Caspase 家族在巨噬细胞内巨噬细胞巨噬细胞分裂的流程中的起着极其重要的最重要作用，其中的 Caspase-3 为最重要的拒绝执行小分子，它在巨噬细胞分裂信号传导的许多途径中的展现功能性。Caspase-3 正常人以酶原（32 KD）的形式假定于胞浆中的，在巨噬细胞分裂的以前过渡期，它被作用于，酪氨酸的 Caspase-3 由两个大核苷酸（17 KD）和两个小核苷酸（12 KD）组出，甘油都可的胞浆胞反应器羧酸，最未能成加剧巨噬细胞巨噬细胞分裂。但在巨噬细胞巨噬细胞分裂的早期和死亡巨噬细胞，Caspase-3 的活性明显下降。

Western blot

归纳 Procaspase-3 的酪氨酸，以及酪氨酸的 Caspase-3 及对羧酸多聚（ADP-反应器糖）聚合酶（PARP）等的甘油。

步骤

收集巨噬细胞→PBS 彩衣涤→抽提巨噬细胞甘油盐酸→受体表征→SDS-PAGE 液相→纤维素上皮细胞或 PVDF 上皮细胞转移→5% 脱脂封闭，固体 1.5～2 h 或 4 °C 驱车→Caspase-3 多抗或他汀固体羧酸 1～2 h 或 4 °C 驱车→TBS-T（另有 0.05% Tween 20 的 TBS）彩衣 3 次，5～10 min/次→HRP-由此可知识的驼抗鼠 IgG 或 AP 由此可知识的驼抗鼠 IgG 固体羧酸 1～2 h→ TBS-T 彩衣 3 次， 5～10 min/次→ECL 冲印或 NBT/BCIP 显色。

结果

紫外线测光全球适配系统归纳

酪氨酸的 Caspase-3 都能特异大块 D1E2V3D4-X 羧酸，分解 D4-X 肽键。根据这一特点，设而所出紫外线物质烯丙基的较总长肽 Ac-DEVD-AMC。在共计价烯丙基时，AMC 不用被诱导紫外线，较总长肽被分解后释不放出 AMC，自由人的 AMC 才能被诱导点火紫外线。根据释不放的 AMC 紫外线风力的大小，可以测定 Caspase-3 的活性，从而再现 Caspase-3 被酪氨酸的程度。

步骤

赚得巨噬细胞正常人或巨噬细胞分裂巨噬细胞→PBS 彩衣涤→较高纯度巨噬细胞甘油盐酸→加有 Ac-DEVD-AMC（caspase-3 紫外线羧酸）→37 °C 羧酸 1 h→紫外线测光全球适配系统（Polarstar）归纳紫外线风力（诱导光风力 380 nm，点火光风力为 430～460 nm）。

结果

流式巨噬细胞拳法归纳

步骤

赚得巨噬细胞正常人或巨噬细胞分裂巨噬细胞→PBS 彩衣涤→加有 Ac-DEVD-AMC→37 °C 羧酸 1 h→UV 流式巨噬细胞而所归纳 Caspase-3 阳性巨噬细胞数和平均紫外线风力。

结果

七TFAR19 受体传达和巨噬细胞适配归纳

TFAR19（PDCD5）是由本学拳法研究室在国内首先报导的一个拥有自己知识产权的人类新的DNA，后半期的功能性学拳法研究表明，它是有利于巨噬细胞巨噬细胞分裂的弱化剂。透过紫外线素（FITC）由此可知识的 TFAR19 单克隆抗躯为电极，对巨噬细胞巨噬细胞分裂流程中的 TFAR19 受体的传达素质及适配学拳法研究发现，巨噬细胞分裂以前 TFAR19 传达素质抬较高并显现较总长整整反应器转位出因，伴随着巨噬细胞质基本上学的变化，持续较总长整整，在巨噬细胞分裂小躯中的仍然可见。

同时我们发现，巨噬细胞分裂以前 TFAR19 受体的反应器转位早于胶体酰糖类（PS）螺旋状和巨噬细胞质 DNA 的录像化，指引 TFAR19 受体的反应器转位是巨噬细胞巨噬细胞分裂更以前愈演愈烈的事件之一。进一步的学拳法研究证明，巨噬细胞分裂以前 TFAR19 的反应器转位具普遍意义，不同巨噬细胞巨噬细胞分裂以前均显现 TFAR19 较高传达和反应器转位。这为学拳法研究巨噬细胞巨噬细胞分裂以前所愈演愈烈的事件，提供了一种新的的新技拳法和指由此可知。

TFAR19 受体的巨噬细胞适配归纳

涂层还原剂

FITC 由此可知识的单克隆抗躯，pH 7.4 、0.15 mol/L PBS，3% 的多聚甲醛，PBS-T（pH 7.4 、0.15 mol/L PBS 另有 0.2% Tween 20），胎牛人体内，紫外线巨噬细胞彩衣盐酸（pH 7.4 、0.15 mol/L PBS 另有 2% 胎牛人体内及 0.1% NaN3），FACS 管，Tip 头，移盐酸器。

祯器

低温素质离心机，37 °C 水浴箱，紫外线全像，共计侧重激光扫描全像，流式巨噬细胞祯。

步骤

1. 碎屑巨噬细胞的切片

（1）赚得正常人和可借巨噬细胞分裂的巨噬细胞（0.5～1×106），PBS 彩衣 2 次，1 000 rpm×10 min。

（2）3% 多聚甲醛冰浴 10 min，PBS 彩衣 2 次，1 000 rpm×10 min。

（3）投身 PBS-T 溶盐酸，37 °C 圈养 15 min，PBS 彩衣 2 次，1 000 rpm×10 min。

（4）投身 200 ml 胎牛人体内，固体羧酸 30 min。

（5）投身 5 ml FITC 由此可知识的 TFAR19 他汀（未能成沸点为 1:40），4 °C 羧酸 30 min。

（6）紫外线巨噬细胞彩衣盐酸彩衣 2 次，1 000 rpm×10 min。

将巨噬细胞硫酸滴片，紫外线全像及共计侧重激光全像下观察 TFAR19 在巨噬细胞中的的适配。同时用流式巨噬细胞祯表征侦测 TFAR19 受体的平均紫外线风力。

2. 贴壁巨噬细胞的原位切片

（1）贴壁生总长的对数期巨噬细胞铺在 24 中空或 6 中空侧边中的（内有净化盖玻片），让其爬片生总长，待总长到 50%～80 % 满时，巨噬细胞分裂可借剂管控巨噬细胞。

（2）将不同整整点管控的巨噬细胞开展免疫紫外线切片，切片步骤同上。

（3）将切片的爬片巨噬细胞不放于一张滴有少量（5 ml）的载玻片上，紫外线全像或共计侧重激光扫描全像观察 TFAR19 在巨噬细胞中的的适配。

3. 临床病理切片的切片、侦测

4. 原代巨噬细胞的培育、侦测

5. 归纳 TFAR19 受体在人躯内各该组织器官的常见于及适配

TFAR19 受体的传达与临床哮喘

ELISA 法侦测正常人人和哮喘静止状态下，以及哮喘的不同时期，人体内中的 TFAR19 受体素质及其 TFAR19 自身抗躯素质。

涂层和还原剂

1. 一般来讲 Buffer：pH 9.6， 0.05 mol/L 碳酸盐 Buffer

2. 彩衣涤盐酸： pH 7.4，0.15 mol/L PBS 另有 0.05% Tween 20

3. 封闭盐酸： 3% BSA（用彩衣涤盐酸配制）

4. 酶由此可知抗躯的混合物：用封闭盐酸混合物

5. OPD 羧酸 Buffer：Na2 HPO4·12 H2O 1.84 g，柠檬酸 0.51 g，DDW 100 ml

6. 显色盐酸（现配现用）：羧酸 Buffer 10 ml，OPD 2 mg，30% H2O2 2 ml

7. 未能成止盐酸 2 mol/L H2SO4

8. 整合人 TFAR19，HRP 由此可知识的驼抗人 IgG9 ELISA 侧边，Tip，移盐酸器，ELISA Reader（OD 490 nm），彩衣侧边机

操纵步骤

1. 用一般来讲 Buffer 混合物的整合人 TFAR19（1 mg/ml）一般来讲 ELISA 侧边，100 ml/well，37 °C 圈养 2 h 或 4 °C 驱车（一般 24 h 以上）。

2. 彩衣涤 Buffer 彩衣侧边三次，投身封闭盐酸，200 ml/well ， 37 °C 圈养 2 h 或 4 °C 驱车。

3. 彩衣涤 Buffer 彩衣侧边三次，投身不同混合物度的产妇人体内（3 个重复中空）100 ml/well ，37 °C 圈养 1 h。设一般来讲 Buffer、彩衣涤 Buffer 、封闭盐酸为阴性相异。

4. 彩衣涤 Buffer 彩衣侧边三次，投身 1:2 500 混合物的 HRP 由此可知识的抗人 IgG， 100 ml/well，37 °C 圈养 1 h。

5. 彩衣涤 Buffer 彩衣侧边三次，投身显色盐酸，100 ml/well，避光羧酸 10～15 min。

6. 投身 H2SO4 未能成止羧酸，50 ml/well。

7. ELISA Reader 读取 OD 490 光密度值，归纳和比较产妇人体内和正常人血 清中的 TFAR19 自身抗躯的传达素质。

8. Western blot 归纳功能性障碍巨噬细胞和正常人巨噬细胞的 TFAR 19 受体的传达素质。

参考文献

Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-induced apoptosis involves cleage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039

Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-5507

文章是从：丁香园站友 midas

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